河豚毒素

生物分布

毒鱼分布

在公元前2500年前的中国和埃及，人们就已知道有些鲀形目鱼类（河鲀）有毒，河鲀毒素之名，也因河鲀而起。而人们通常所指的河鲀（并非河豚）（puffer fish），为鲀科鱼类，泛指硬骨鱼纲、鲀形目、鲀科的各属鱼类，鲀科鱼类是最常见的含河鲀毒素的水产品。中国的鲀科鱼类共有54种，其中东方鲀属22种。根据伍汉霖等调查，中国共有35种河鲀具有不同程度的河鲀毒性，其中，在中国南海分布的有24种，在中国东海包括台湾沿海分布的有31种，在中国黄海分布的有14种，在中国渤海分布的有10种。少数种类能洄游进入江河，如晕环东方鲀（Takifugu coronoidus）、暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus）、弓斑东方鲀（Takifugu ocellatus）、铅点东方鲀（Fugu alboplumbeu）、兔头鲀（Lagocephalus lagocephalus）、横纹东方鲀（Takifuguoblongus）等。这些鱼类年产量约在3-4万吨，占世界河鲀总产量的70%左右。

在河鲀体内发现含河鲀毒素的器官或组织有肝脏、卵巢、皮肤、肠、肌肉、精巢、血液、胆囊和肾等，其中肝脏含河鲀毒素的河鲀有34种，卵巢含河鲀毒素的有32种，皮肤含河鲀毒素的有21种，肠含河鲀毒素的有21种，肌肉含河鲀毒素的有13种，精巢含河鲀毒素的有8种，血液含河鲀毒素的有4种，胆囊含河鲀毒素的有4种，肾含河鲀毒素的有1种。有些种类的河鲀，地理分布不同，其体内毒素分布的部位会也有所不同，如台湾海域的纹腹叉鼻鲀（Arothron hispidus），其肌肉就有毒性了，而在南海海域，肌肉中则没有河鲀毒素分布；又如东海南部的横纹东方鲀（Takifugu oblongus），仅卵巢、肝脏和肠中含河鲀毒素，而在台湾沿海的横纹东方鲀，体内河鲀毒素分布较为广泛，在卵巢、肝脏、肠、胆囊、精巢、肌肉和皮肤中均有分布，不同河鲀的河鲀毒素分布器官或组织中的河鲀毒素量也不同。

程苏云等调查了浙江沿海8种河鲀的毒性，菊黄东方鲀肝和皮肤有很强的毒性，均达到445鼠单位，而黄鳍东方鲀各部位的毒性均较低。暗纹东方鲀卵巢从III发育到Ⅵ期。卵巢的河鲀毒素含量不断升高，在V期达到最高。然后下降。肝脏的河鲀毒素含量也不断升高，但毒素含量增加不如卵巢明显，在性腺发育各个时期，眼球、心脏、脾脏、胃肠、皮中的河鲀毒素含量没有显著提高。用河鲀毒素单抗检测虫纹东方鲀（Takifugu vermicularis）的卵巢，发现河鲀毒素累积在卵母细胞的细胞核、卵黄囊和卵黄颗粒中，而在凹鼻鲀（Chelonodon patoca）的卵巢，河鲀毒素累积在卵巢的结缔组织和卵母细胞的细胞核中，在虫纹东方鲀、凹鼻鲀和墨斑凹鼻鲀（Chelonodon nigroviridis）的皮肤中，发现河鲀毒素累积在腺体和粘液细胞中。

其他含毒生物

河鲀毒素及类似物不仅存在于各种豚科鱼中，还广泛分布于各种高等、低等生物中，如云斑裸颊虾虎鱼（Yongeichthys criniger）、织纹螺（Nassarius spp.）等。Asakawa等首次报道牡蛎吊筏上的纽虫体内含大量的河鲀毒素、4-表河鲀毒素、脱水河鲀毒素及3种未知毒素，最高毒性为14734MU/g。这种纽虫体质量仅为0.2-1.0 g，就足以杀死13000只小鼠。纽虫的毒性变化很大，认为纽虫可能通过共生的微生物产生河鲀毒素或前体。而自1964年Mosher等首次在河鲀鱼外的动物蝾螈中发现河鲀毒素以来，人们对蝾螈体内的河鲀毒素及其大量衍生物（1-Hydroxy-5，11-dideoxytetrodotoxin、6-表河鲀毒素）的研究兴趣越来越浓，主要集中在阐述这种低等动物的代谢途径。从粗皮渍螈Taricha granulosa体内分离出河鲀毒素的10，7内酯型，该成分在河鲀毒素合成的第十五步环节中作为前体物质，故研究蝾螈的代谢途径将有助于更好地解释河鲀毒素的起源。从亚历山大藻培养液中检出一定量的河鲀毒素，表明亚历山大藻体内麻痹性毒素和河鲀毒素同时存在。Kodama等认为这种麻痹性贝毒的生产者—亚历山大藻，可能是河鲀毒素的来源。即亚历山大藻也是贝类中河鲀毒素毒性的来源，当亚历山大藻大量繁殖时，贝类体内也积累着高含量的河鲀毒素。

其他含有河鲀毒素的生物有一个共同点，即其体内含有多种能分泌毒素及其类似物的细菌。已从海藻、花纹爱洁蟹（Atergatisfolridus）、多棘槭海星（Astropecten polyacanthus）、圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）、虫纹东方鲀（Fugu vermicularis）和星点东方鲀（Takifugu niphobles）、腹足动物（Niotha clethrate）、纽虫动物中陆续分离到产TTX的细菌，淡水沉积物中也有此类菌、海洋沉积物中分离的链霉菌（Streptomycessp.）能产TTX及其衍生物、海胆（Meoma ventricosa）中分离的致病菌VL21也被证实有产毒能力。产TTX的微生物类群有弧菌属（Vibrio）的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、假单胞菌属（Pseudomonas）、希瓦氏菌属的腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens）、交替单胞菌（Alteromonas）、芽孢杆菌（Bacillus）；放线菌属的链霉菌（Streptomyces）。

物化性质

化学性质及结构

河鲀毒素（tetradotoxin，简写为TTX）系小分子量非蛋白质神经毒素，中毒潜伏期短，死亡率高，毒素吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导产生障碍，首先感觉神经麻痹，而后运动神经麻痹，严重者脑干麻痹导致呼吸循环衰竭。河鲀的表皮、内脏、血液、睾丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同组织中含有河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX），它是一种剧毒的非蛋白神经毒素。其分子式为C11H17O8N3，分子量为319，该神经毒素经腹腔注射对小鼠的LD50为8μg/kg。TTX的化学性质稳定，一般烹调手段难以破坏。

河鲀毒素是一种重要的天然毒素。1909年日本学者田原纯首先从河鲀鱼中发现，并定名Tetrodotoxino 1950年-1957年间，横尾晃、津田藤介等人首先从红鳍东方鲀，紫色东方鲀卵巢中独立地分离到了结晶态的河鲀毒素。其为无臭、易潮解的白色结晶体。该毒素结构的测定由Woodward（哈佛大学）、平田和后藤（名古屋大学）及津田小组（东京大学一三共中央研究所）等分别完成。1964年在京都召开的国际天然产物化学会议上同时报告了TTX的正确结构，是一种分子量不大，但结构很复杂的笼形原酸酯类生物碱，分子中几乎所有的碳原子均有不对称取代。因此它也被称为“自然界最奇特的分子之一”。

TTX是一种氨基全氢喹唑啉（Aminoperhydroquinazoline）型化合物，为白色结晶，无臭无味，微溶于水，不溶于有机溶剂；对酸作用稳定，对碱极不稳定；没有确定熔点，220℃以上炭化。TTX的结构特征是有1个碳环，1个胍基，6个羟基，在C-5和C-10位有一个半醛糖内酯连接着的分开的环。在胰液酶、唾液淀粉酶、乳化酶、糖转化酶等酶类存在下不分解。只溶于酸性水或醇溶液，在碱水溶液中易分解，在5%氢氧化钾溶液中于90-100℃下可分解成黄色结晶2-氨基-羟甲基-8-羟基-喹唑啉。它是相当特殊的一种有机化合物，分子内的胍基与氮原子是质子化的，正羰酸也离解为阴离子，所以河鲀毒素是以内盐形式存在。在室温下用50 g/L的氢氧化钡处理河鲀毒素可得脱水河鲀毒素—由pKa1值为2.5的羧基和pKa2值为10.9的胍基组成的两性离子化合物，其可在水中与一分子的溴完全反应产生河鲀酸。河鲀毒素在酸中也能部分异构化为脱水表河鲀毒素，从而影响对河鲀毒素的提取纯度。所以，河鲀毒素制剂经过长时间放置可降解。至于河鲀酸是否具备毒性尚有争议。因此，在生物代谢过程中，脱水和脱氧过程会降低毒性，而加氧机制能够使毒性增强。

在河鲀鱼中，河鲀毒素与其同系物是同时存在的。河鲀毒素的同系物种类较多，从河鲀、纽虫、两栖类等生物体内分离得到的同系物包括：4-epiTTX，6-epiTTX，11-deoxyTTX，11-deoxy-4-epiTTX，11-norTTX-6（R）-ol，11-norTTX-6（S）-ol，11-norTTX-6,6-diol，4,9-anhydroTTX，11-oxoTTX，4,9-anhydro-4-epiTTX，4,9-anhydro-11-deoxyTTX，5-deoxyTTX，tetrodonicacid，4，9-anhydro-6-epi-TTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX等。这些同系物可能与河鲀毒素的代谢或生物合成有关。在河鲀毒素的同系物中，5-deoxyTTX、5,6,11-trideoxyTTX、4-CysTTX、4,9-anhydroTTX、4,9-anhydro-6-epi-TTX、河鲀酸等同系物的毒性较低，甚至无毒，而11-oxoTTX虽比较罕见，其毒性却是TTX的4-5倍。它们与河鲀毒素性质相似，有一定的生理活性，如：河鲀毒素的小鼠LD50为10μg/kg，6-表河鲀毒素为60μg/kg，11-去氧河鲀毒素为71μg/kg。 

提取与精制

TTX具有镇痛、降压、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。对河鲀毒素的提取分离研究首先是晶化问题。自从田原于1909年首次分离到TTX的粗素以来，经过了40年，直到横尾（1950）、津田（1952）、荒川（1956）、平田（1957）等人，才分离出TTX结晶，其分离方法分别为：横尾法（氧化铝柱层析），津田—河村法（圆形滤纸层析法），津田—河村大规模生产法（活性炭层析法），平田—后藤法（离子交换树脂—活性炭吸附法）等。通常TTX的提取步骤是：河鲀卵巢—水提取—除蛋白质—离子交换—脱色—活性炭吸附—浓缩—精制—结晶。现代分离河毒素多采用层析法，其具体方法如下：首先，把富含毒素的样品绞碎，与含1%醋酸的甲醇液一起匀浆以抽提河毒素，匀浆液经5000-6000r/min，离心10-15min，沉淀物再用以上方法重复两次。合并上清液，减压浓缩，并用氯仿除去脂肪。之后经过冷冻干燥或再减压浓缩，浓缩液经Bio-Gel-P2或CM-Sephadex C-25（NH4+）或Amberlite IRC-50（NH4+）层析，用0.1-0.4 mol/L醋酸洗脱，合并有毒成分，浓缩后再经Bio-Rex70（H+）层析，以0.1-0.3mol/L醋酸洗脱，然后再重复一次，Bio-Rex70（H+）柱层硒，即可得到纯度非常高的样品。

日本人田原最早制得的TTX，纯度只有0.2%，半数致死量LD50为4.1mg/kg；横尾用磷钨酸、苦味酸汞、苯肼、苦味酸汞和苦酮酸等依次处理，得到的粗毒素的LD50为800μg/kg；此后，横尾又采用氧化铝柱直接过滤的方法制备，得到的TTX的LD50为13μg/kg。中国于1958年开始进行TTX的提取分离工作。陈成添等采用热甲醇法、微火煮沸法、沸水浴法对河鲀混合卵和混合肝的毒素进行提取，结果显示，用这三种方法提取的混合卵毒力的均值分别为：热甲醇法1524，微火煮沸法2518，沸水浴法2491。微火煮沸法和沸水浴法提取效果较佳，热甲醇法较差。杨春等以含毒量低的棕斑腹刺鲀为对象，研究以甲醇、乙醇、乙酸、水等4种溶剂提取TTX，结果发现乙酸的提取效果最好。林文銮等提出用甲醇乙酸法提取TTX较完全，以活性炭脱色纯化的效果最好，但毒力有一定的损失。李世平等以离心法取代传统过滤法，并用减压浓缩法去除提取液中的乙醚，改进了乙酸提取法，提高了得率。TTX的分离和提取大多采用离子交换、活性炭柱层析及凝胶柱层析、吸附树脂等方法。津田一河村用活性炭层析，采用以甲醇提取的浸膏上活性碳柱，以0.8%醋酸-10%甲醇-水洗脱，粗结晶溶于醋酸，加入氨水，低温下重结晶，1000kg卵巢中可获得10gTTX。郭慧清等联合采用吸附树脂D+D101与弱酸性阳离子交换树脂D152提取河鲀毒素，改进了除蛋白质的方法。国海洋大学的崔建洲等利用D201大孔树脂层析、超滤、离子交换层析、分子筛层析、反相制备液相色谱等方法，从假睛东方鲀的肝脏中分离纯化得到TTX晶体，得率为81.1%。另外，中国国家海洋局第三研究所采用多重膜分离提取技术结合高效液相色谱法制备河鲀毒素纯品，纯度可达99.0%以上。

苦味酸盐法的氨解也可制备TTX纯品，其步骤如下：将粗品毒素（3.2g）和苦味酸（2.3g）溶于29 ml沸水之中，趁热过滤。冷却滤液，分离结晶沉淀，此沉淀在热水中重结晶3次，得黄色针状结晶的TTX苦味酸盐（4.8g）。此盐在200℃以上变黑，但不溶。元素分析样品需于80-100℃真空干燥20h。用4.7g苦味酸盐在热水中溶解，以氨水调节pH至9，冷却后，过滤出沉淀固体并加水洗涤。再溶于少量稀醋酸，加入氨水再沉淀，可得到纯TTX 2.6g。

根据河鲀毒素的微生物起源，分离出产河鲀毒素的微生物类群，通过微生物发酵来产生河鲀毒素。产TTX 的微生物类群有弧菌属（Vibrio）的溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）和鳗弧菌（Vibrio anguillarum），假单胞菌属（Pseudomonas），希瓦氏菌属的腐败希瓦菌（Shewanella putrefy aciens），交替单胞菌（Alteromonas），芽孢杆菌属（Bacillus），链霉菌属（Streptomyces），其中产毒力较高的主要是溶藻弧菌和河鲀毒素互生单胞菌（Alteromonas tetrodonis）。但微生物产河鲀毒素产量非常低，仅为ng级。其产生机制尚不清楚。

毒理

作用机制

1982年，美国植物学家韦德-戴维斯发现，海地巫毒教中的回魂大师在药物中使用含有从河鲀提取的毒素粉末，整个过程里中毒者大脑能完全保持清醒，如果能挺过24h，他们就会很快恢复正常，且不会出现并发症。使人们相信他们有使人“死而后生”的能力，即所谓的“还魂术”。其实，这是由于河鲀毒素的特殊结构使其像塞子一样，凝固在神经轴突的钠离子通道的入口处，阻碍钠离子透过细胞膜传导神经的冲动，从而关闭神经系统。由于河鲀毒素不能越过大脑中血液细胞的屏障，因此受害者就会处于大脑清醒的无助状态之中。几小时或几天过后，当河鲀毒素最终开放钠离子通道时大多数受害者已经死亡。

TTX是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动物电位，抑制神经肌肉间兴奋的传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX的活性基团是1，2，3 位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10 位的羟基，胍基在生理pH值下发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离子进入通道。钠离子受体至少有6个特异性靶分子结合位点，TTX是与钠通道受体部位I结合。TTX受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX与受体部位结合，阻碍钠离子接近通道外口。研究表明，TTX特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作用。总的来说，TTX对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。

河鲀毒素毒理作用的主要表征是阻遏神经和肌肉的传导。除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外，河鲀毒素被机体吸收进入血液后，能迅速使神经末梢和神经中枢发生麻痹，继而使得各随意肌的运动神经麻痹；毒量增大时会毒及迷走神经，影响呼吸，造成脉搏迟缓；严重时体温和血压下降，最后导致血管运动神经和呼吸神经中枢麻痹而迅速死亡。TTX可选择性地抑制可兴奋膜的电压，阻碍Na+通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经肌肉丧失兴奋性。此后，多数研究工作都是围绕着TTX阻断可兴奋组织的Na+通道而展开。河鲀对TTX具有抵抗力和免疫性。如果该区域出现由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置换，就会显著影响它与TTX结合的灵敏度。在对河鲀毒素没有免疫力的生物体内，钠通道的α-亚基上存在河鲀毒素的受体，河鲀毒素与α-亚基门孔附近的氨基酸残基结合，阻止钠离子进入细胞内，引起河鲀毒素中毒。而河鲀体内细胞的构造与其他生物不同，河鲀体内还存在可以与河鲀毒素结合的其他蛋白质，从而使河鲀对体内的河鲀毒素具有免疫力。比较红鳍东方鲀（Fugu rubripes）、黑青斑东方鲀（Tetraodon nigroviridis）和斑马鱼的基因序列图谱，发现红鳍东方鲀和黑青斑东方鲀骨骼肌的Nav1.4通道发生了变异，正是这种变异使河鲀具有抵抗河鲀毒素的能力。红鳍东方鲀和豹纹东方鲀的变异类似，都是在Nav1.4通道的401位点上发生了取代，取代为一个折叠程度更高的不饱和氨基酸。河鲀的这些氨基酸是不与河鲀毒素结合的，从而也就不能对河鲀的钠通道造成影响。通过克隆调控豹纹东方鲀骨骼肌Nav1.4通道表达的cDNA，发现Nav1.4通道区域Ⅰ401位点处存在一个不饱和氨基酸，即天冬酰胺。通过基因工程把不饱和氨基酸移植到对河鲀毒素敏感的小鼠骨骼肌Nav1.4通道处，移植的不饱和氨基酸的折叠程度越高，小鼠抵抗河鲀毒素的能力越强。当不饱和氨基酸的折叠程度大于取代位点氨基酸折叠程度的2500倍时，IC50（50%Na+通道发生阻断时河鲀毒素的浓度）提高至47μmol/L。

一些生物对河鲀毒素的耐受性与其独特的钠离子通道结构有关。研究发现，3×10-6M的河鲀毒素对Arothron hispidus等7种河鲀鱼肌肉的动作电位没有影响，而3×10-7M的河鲀毒素却阻断了3种不含河鲀毒素的其他鱼的动作电位。河鲀毒素的结合位点位于钠离子通道内高度保守的成孔区域（P-loop），对河鲀毒素敏感的钠离子通道（TTX-sensitiveNa+channel）在该区域有与TTX高度亲和的芳香性氨基酸。如果该区出现由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置换，就会显著影响其与TTX结合的灵敏度，从而使钠离子通道成为抗河鲀毒素的钠离子通道（TTX-resistantNa+channel）。通过对河鲀鱼（Fugu pardalis）骨骼肌Nav1.4通道的cDNA基因序列图谱的研究发现，通道的结构域I的成孔区域的401位置包含有一个非芳香氨基酸，即天冬酰胺酸，而此位点发生的氨基酸置换可能与河鲀鱼对高浓度的TTX耐受有关。在捕食与防御的长期进化过程中，在北美西部，一些束带蛇对河鲀毒素也具备了一定的耐受力，而且，不同地区的束带蛇对河鲀毒素的耐受力也有明显差异。对这些束带蛇的Nav1.4通道进行分析发现，他们的芳香氨基酸在401位点是保守的，但在结构域IV的成孔区域发生了几处氨基酸置换。在WillowCreek地区的束带蛇的Nav1.4通道的结构域IV包含有3个氨基酸的置换，该地区束带蛇对TTX的耐受力比Benton地区的高两个数量级，因为后者只包含1个氨基酸替代。只在河鲀鱼与束带蛇中发现它们对河鲀毒素的耐受性与其骨骼肌和神经元的钠离子通道发生了氨基酸替代有关。这两种生物之间的一个主要差别就是，几乎所有的河鲀鱼对TTX都有一定的耐受性，而且有相同耐受机制，但是只有一部分束带蛇具有对TTX的耐受力。

毒素起源

起源内因说

主张内因说的学者认为，河鲀等生物体含有的刺胞、毒腺中的蛋白质毒素是内源性毒素的来源。他们推测河鲀鱼体内有特定功能或微生物，能将摄入的食物转化为毒素。但始终没有更多证据证实这种说法，因此内因说没有得到广泛认可。不少研究者认为，许多海洋细菌能产生河鲀毒素，作为河鲀鱼类食物的一些动物，如海星等也含有河鲀毒素，而人工饲养的河鲀却没有河鲀毒素，表明河鲀本身并无产生TTX的能力。但后来河鲀毒素由细菌产生的观点遭到了反驳，Kmatsumura在1995年就发现从解藻朊酸弧菌（Vibrio alginolyiicus）中提取出来的河鲀毒素并没有与河鲀毒素的单克隆抗体发生反应，认为生物鉴定法存在弊端，因此有必要重新认识“TTX是由细菌产生的”这一观点。为了证实产生河鲀毒素的原因是内源性的，Kendo于1998年提取了星点东方鲀成熟的卵细胞进行人工授精及胚胎培育，发现在孵化过程中胚胎体内河鲀毒素的含量一直在增加。这表明增加的毒素是胚胎的产物。由此可知，河鲀体内的TTX可能并非直接来源于细菌，而是河鲀本身与其体内共生细菌共同的产物。河鲀等动物自身是否具有分泌毒素的功能，以及河鲀毒素如何在机体各器官内发生转移等，还有待进一步研究。

而且，河鲀毒素在河鲀之外的物种分布，和河鲀体内细菌能分泌河鲀毒素等现象，不能说明河鲀本身不能产生河鲀毒素。Matsumura就对河鲀毒素的细菌起源提出了质疑，他发现弧菌（Vibrioalginolyticus）所产的河鲀毒素并不能和河鲀毒素的单克隆抗体反应，说明细菌产生的河鲀毒素与河鲀体内的河鲀毒素并不完全相同。 但细菌产生的河鲀毒素同样能使小鼠致死，说明其可能是河鲀毒素的衍生物。但是，内源假说同样不能解释一些事实，仅在投喂配合饲料的条件下，人工养殖的河鲀体内的河鲀毒素没有或含量很低，此事实很难用内源假说来解释。Matsui等认为河鲀体内有一种能够储藏TTX的机制。但是，如果河鲀仅仅能储藏河鲀毒素，同样也难以解释胚胎发育过程中河鲀毒素含量一直在增加的现象。因此，河鲀体内的河鲀毒素极有可能是河鲀与其体内共生细菌共同的产物，体内共生细菌产生河鲀毒素的衍生物，河鲀把此衍生物转化为河鲀自身的河鲀毒素。河鲀胚胎发育过程中河鲀毒素含量一直在增加，可能是共生细菌产生的河鲀毒素衍生物，在卵子受精前就已经累积在卵中，受精后的胚胎发育过程中，河鲀胚胎逐渐具备把此衍生物转化为自身河鲀毒素的能力。因此，胚胎发育过程中河鲀毒素含量可持续增加。

外因说

在Mosher等从加州蝾螈（Tarichatorosa）中分离到河鲀毒素以前，河鲀毒素一直被认为是河鲀产生的，之后，在虾虎鱼、蛙类、马蹄蟹、海星、纽虫、箭虫、环节动物、石灰质藻类等中均分离到河鲀毒素，使人们相信河鲀毒素的分布比较广泛。1986年，Noguchi等首次报道了从花纹爱洁蟹（Atergatisfloridus）的肠道内分离到一种产河鲀毒素的细菌，1987年，Noguchi等从虫纹东方鲀肠道中也分离出能产河鲀毒素的细菌Vibrio alginolyticus，此后，从各种动物的多种动物体内或体表、海洋沉积物、淡水沉积物中也分离到了产河鲀毒素及其衍生物的各种微生物，这些发现，使人们更加相信河鲀体内河鲀毒素的体外起源假说，日本的清水、松居是最早提出“外因说”的学者。他们用含TTX的饵料饲喂人工养殖的无毒河鲀及人工采苗后饲养的河鲀，结果这些无毒河鲀发生毒化现象。由此推测，毒素的起源可能是外因性的。该假说认为河鲀体内河鲀毒素来源于环境中的河鲀毒素或产河鲀毒素的细菌。

Noguchi等采用小鼠和液相-质谱技术调查了日本1990到2003期间在离开海底10米以上的网箱养殖红鳍东方鲀的河鲀毒素毒性情况，在肝脏、皮肤、肌肉、性腺中均没有检测到河鲀毒素（检测灵敏度<0.1MU/g），表明喂养人工配合饲料的红鳍东方鲀没有毒性，说明可以通过远离海底沉积物能有效培养无毒的红鳍东方鲀。而Hwang等发现，不同水质对人工养殖的红鳍东方鲀的毒性往往是有影响的，在台北宜兰县两个养殖基地养殖的红鳍东方鲀是无毒的，而在毗邻的台北县养殖基地养殖的红鳍东方鲀的卵巢在1-3月是有毒的，肝脏在1-3月是有弱毒的。江苏宜兴人工养殖的暗纹东方鲀所有受检的器官组织均是无毒的。采用投喂配合饲料和在淡水环境养殖暗纹东方鲀，其1-3龄均为无毒或低毒。华元渝等采用高效液相色谱仪和荧光分光光度计联合法随机抽样检验经过纯全人工繁殖、苗种培育至商品鱼的暗纹东方鲀毒性，结果表明其体内4种组织器官中的河鲀毒素平均含量低于2μg/g，属基本无毒。

Nagashima等提出河鲀体内的毒素是通过食物链富集的，河鲀肝脏的薄切片吸收河鲀毒素的能力比其他鱼类肝脏的薄切片要强。实验也证明，人工养殖的河鲀不含河鲀毒素，但是在饲料中添加有毒河鲀的肝脏，养殖河鲀体内就含有河鲀毒素。大多数学者认为河鲀体内的河鲀毒素是受食物链和微生物双重影响的结果。

在河鲀毒素起源方面研究得最多的是东方鲀。一般认为，降海洄游的河鲀产生河鲀毒素的可能性有以下几种：（1）东方鲀下海后在海水环境中自身产生TTX；（2）海水中某些生物含有TTX，被河鲀吞食后吸收并储藏、浓集于体内；（3）许多海洋生物的代谢产物中含有TTX。从研究来看，河鲀自身产生河鲀毒素的可能性不大，因为除了河鲀外，海洋中还有许多河鲀喜食的生物体内都含有TTX。另外，生存于淡水中未经降海洄游的河鲀体内检不出TTX，也说明河鲀自身不产毒。但在投喂含TTX的饲料一段时间后，其体内又能检出TTX。因此，TTX很有可能是通过食物链在河鲀体内聚集的。而且，海洋中许多含毒细菌黏附于河鲀喜食的生物体表，进入河鲀体内后就与其形成互利共生的关系，河鲀可通过皮肤腺的暴露来释放TTX，从而起到抵御天敌的作用。

Noguchi等在对麻痹性贝毒导致蟹类毒化的机制的追踪过程中，从石灰藻及毒蟹内脏中分离到了可产生毒素的细菌，经鉴定，它们是假单胞菌属（Pseudomonassp.）细菌。从该菌培养液中得到的两种毒素，经FLD-HPLC法及红外光谱、质谱分析法分析，确证为TTX及脱水TTX。进一步将其分别注射入小鼠腹腔，显示了与TTX和脱水-TTX相对应的致死率，从而确证TTX为细菌的代谢产物。Thuesen等从4种毛颚动物（Chaetognatha）体内分离到34株弧菌属（Vibriosp.）海洋细菌，其培养物和胞外产物均可阻断Na+通道。经组织培养法及液相色谱等方法同样确证该产物为TTX。由此可见，产TTX的细菌是多样性的。吴韶菊等通过分离和筛选河鲀各个器官内的细菌，从36种细菌中挑选出了20种能分泌TTX的细菌，并发现卵巢和肝脏中TTX的含量高，其内部所含的菌株数量和毒性也都比其他组织高，从而说明河鲀所含的TTX与其共生细菌密切相关。

河鲀毒素的“体外起源”假说假定所有能产生TTX的生物都与其体内能分泌TTX的微生物有着密切联系，并且已被随后从各种携带TTX的生物体内提取出来的能产生TTX的细菌所证实。另外，TTX的累积机制不仅可通过食物链获得，也能由其自身肠道内的细菌产生，因为海洋中有些生物也摄食与河鲀同样的食物，但它们的体内并不含有TTX，从而估计河鲀体内有一种能够储藏TTX的机制。大多数研究者都认为，河鲀体内的TTX是受食物链和微生物双重影响的结果。

河鲀体内TTX的含量不仅存在个体间的差异，并且其体内各组织中TTX的含量也存在明显的差异。一般卵巢和肝脏中含量最多，精巢次之，皮肤和肌肉中则是微量或没有。Yuji等将河鲀的肝脏组织培养在含TTX的培养液中，发现它能吸收TTX，证明河鲀肝脏并不能分泌TTX，而是吸收体外的TTX。这也进一步证明了河鲀体内的TTX是外源性的。

其他学说

有学者从免疫学的角度对河鲀富集河鲀毒素的机制进行了解释。用河鲀毒素做生物免疫实验，用相同浓度的河鲀毒素微量注射于有毒河鲀、无毒河鲀和小鼠体内做毒性实验。结果发现，有毒河鲀对河鲀毒素的免疫耐受能力最强，无毒河鲀的免疫耐受能力比小鼠的强。由此推断，有毒河鲀对河鲀毒素具有特殊的免疫耐受调控机制。也有学者从分子生物学角度进行了论证。Yotsu-YamashitaM等研究认为，在河鲀体内存在一种蛋白质，可与河鲀毒素联结形成复合物，Matsui等也已经从星点东方鲀中提取出了河鲀毒素与蛋白质联结形成的复合物。Jeen等从河鲀肝脏内提取mRNA，逆转录得到cDNA，通过cDNA末端扩增，发现cDNA中纤维蛋白原基因（flp）的含量与河鲀毒素的毒力水平呈线性关系。由此可以推断，河鲀体内的河鲀毒素是与蛋白质联结在一起以复合物的形式存在，并且河鲀毒素的含量是受基因调控的。人们对河鲀富集河鲀毒素的机理从不同的角度进行了论证，但没有形成统一的观点。不过养殖的河鲀毒性较低，这为开放河鲀鱼市场提供了理论依据。

检测方法

河纯毒素在发现之初人们就在不断寻找其更好的检测方法。河鲀毒素检测常用的方法有小鼠检测法、酶联免疫法、薄层色谱法、柱后衍生高效液相色谱检测法、气质联用法和液质联用等。国外较多地采用气质联用、液质联用的方法检测河鲀毒素。

小鼠生物法（以30分钟内将一体重20克小鼠致死所用河纯毒素的量为一鼠单位）是最常用、最直观的检测方法，通过小鼠死亡前所呈现出的典型的河鲀毒素中毒症状，可迅速地将河鲀毒素与其它致死性物质区分开。最早对河毒素进行定量分析研究是在1941年，当时斯坦福大学在研究蝾螈毒素时引进了鼠单位（Mouse unit，MU）概念。其原理是，一定体重的小鼠经腹腔注射TTX后，其死亡时间的倒数与注射TTX剂量之间存在着线性关系，因此可根据小鼠死亡时间推断TTX的含量。此法测得的毒力用小鼠单位（mouse unit，MU）表示。黄登福等采用同样的方法，使用ICR品系小鼠建立了测试TTX毒素的方法，1MU=0.178μgTTX。但实际使用时因个体差异大、重现性不好，而且需有一定规模才能客观反映实验结果，因此该法的应用受到限制。 

免疫酶技术是20世纪60年代发展起来的新的免疫测定法，它是抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用原理的有机结合。Watabe等首先于1989年建立了用牛血清白蛋白（BSA）连接河鲀酸（TDA）作为抗原的酶联免疫吸附检测（ELISA）法，检出限为0.3-1000.0mg/L。李世平等应用小鼠生物试验和间接竞争抑制酶联免疫吸附试验（ELISA）同步检测17份河鲀肝组织和20份河鲀肌肉组织中的河鲀毒素含量，并对2种方法的检测结果进行比较。结果表明，ELISA法与小鼠生物试验法测得的结果相符合。由于ELISA法测定程序简便易行，速度快，灵敏度高，因而在河鲀毒素的定量检测以及预防河鲀中毒方面具有广泛的应用前景。

高效液相色谱是分析、制备领域应用最为广泛也最为成熟的技术之一，它具有分离效率高、分辨率好及速度快等特点。张虹等采用醋酸与TTX结合形成离子对在ODS柱上采用紫外检测器直接测定TTX含量，该方法操作简单、快速、准确，最低检测限50ng。王小逸等还利用蒸发光散射检测器进行TTX测定，该法可用于微克水平河鲀毒素含量的测定。刘海新等采用柱后衍生高效液相色谱法检测水产品中的河鲀毒素含量，样品先由0.1%乙酸提取，再经过C18固相萃取柱净化。以庚烷磺酸钠为离子对试剂，应用反相离子对液相色谱分离河鲀毒素，采用在线柱后衍生系统，荧光检测器定量检测。河鲀毒素在5-1600ng的范围内呈良好的线性相关，相关系数r=0.9997；1、2、8μg/g，3个浓度水平添加样，日内和日间的回收率为80.9-91.2%，相对标准偏差为1.93% -5.57%；方法定量限为1μg/g。高效液相色谱荧光检测器要比紫外检测器具有更低的检测限，而TTX没有荧光吸收，所以必须先要衍生化成具有荧光吸收的物质，操作比较繁琐。

随着质谱技术的发展，质谱所具有的超强定性能力使色谱质谱联用成为分析行业最有效最准确的分析方法之一。1993年SaitoT利用气-质联用从刀鱼中检测到TTX及其同分异构体的存在。Nagashima等利用气-质联用从暗纹东方鲀肝脏含有的高分子物质中检测到河鲀毒素的存在。吴平谷等用2%乙酸/甲醇提取出河鲀毒素，用正己烷脱脂，然后用碱将河鲀毒素水解成2-氨基-8-羟基-6-羟甲基-喹唑啉（C9碱），水解液经过C18、SLH固相萃取柱净化，BSTFA衍生，采用气相色谱—质谱法全扫描方式测定。液相色谱质谱法比气相色谱质谱法具有更广的应用范围，不需要衍生化，大大简化了分析手段。Tsai等采用了液相/质谱联用法来测定河鲀中的TTX。李爱峰等应用C18反相色谱柱和HILIC亲水作用色谱柱，建立了河鲀毒素（TTX）的液相色谱—电喷雾离子阱质谱联用分析方法。郑雍怡等建立了在大鼠腹腔注射给药后，测定其血浆中河鲀毒素的高效液相色谱—质谱联用（LC/MS）定量检测方法。王洪允等建立了LC-MS-MS测定血浆中河鲀毒素的检测方法，其检测限浓度为1ng/mL。

荧光法是最早建立的定量检测TTX的仪器分析方法。1976年，Saito等首先提出了荧光法，原理是加碱水解后生成2-氨基6-羟甲基8-羟基喹唑啉（简称C9碱），该物质发荧光，建立了最早的荧光分析法；其后，又有研究对荧光检测法进行了改进，建立了连续自动荧光分析方法。陈玉仁等建立了紫外分光光度法。该法与荧光法相比，二者最低检出限接近，但后者仪器设备较便宜。

Nagashima等建立了薄层色谱快原子轰击质谱的测定方法。先在LHP-K板上进行TLC，纯化TTX及其衍生物，然后用质谱定量，最低检出限为0.1g。此法可以区分在其它TLC方法中难以区分的TTX和脱水TTX，其优点还在于不需TMS硅烷化，甚至当被测物的TLC行为不清时也可以测定。1988年，王健伟研究建立了不需水解的薄层色谱（TLC）分析方法用于TTX的定量检测。采用火焰离子检测器，不需将TTX降解为C9碱，避免了衍生反应过程中可能存在的干扰。

医学作用

河鲀毒素的显著作用之一是产生严重的低血压，5×10-4μg·g-1就可产生降压作用。Kao等的实验证实，在α和β肾上腺素受体阻断剂存在时，TTX具有血管舒张作用。TTX使血管逐渐麻痹，外周血管阻力减小，造成血压下降。在培养的牛肾上腺髓质细胞，TTX尚可抑制肾上腺细胞释放儿茶酚胺。尽管腹腔注射极微量TTX（4×10-4μg·g-1）不影响猴的收缩压和舒张压，当微量的TTX与心得安合用时可短时降低舒张压；与戊脉安合用时能降低收缩压和舒张压。国产河鲀毒素0.05×10-32.0×10-3μg·g-1给家兔静脉注射、0.5×10-32.0×10-3μg·g-1给大鼠静脉注射均能产生降压作用。离体血管及离体心脏实验证明，TTX无直接扩张血管作用，但可明显抑制心脏，推测河鲀毒素的降压作用与抑制心脏作用有关。

河鲀毒素中毒所致昏迷患者中有“假性昏迷”的存在。假性昏迷的原因推测为：运动神经肌肉接头处被阻滞，出现四肢瘫痪、腱反射消失、压眶反射消失及周围性呼吸肌麻痹；部分脑干受抑制，而大脑皮质未受到完全抑制，导致四肢瘫痪、血管运动中枢和呼吸中枢麻痹。确切机制仍需进一步探讨。

由于河毒素独特的作用机制，使人们对其结构产生了浓厚兴趣。因此，通过对毒素分子母核的研究，有可能人工合成一系列控制神经肌肉细胞膜作用机制的药物。临床上，河毒素针剂可以代替吗啡、杜冷丁、阿托平和南美筒箭毒等，用于治疗神经痛，镇痛的时间可达12-20h。河毒素的毒性较大，在使用上受到一定限制，但在临床上可有以下几方面的用途：（1）镇痛，含TTX的注射剂曾用于治疗神经痛、癌痛、关节痛、肌肉痛、麻疯痛以及因创伤、挫伤、烧伤引起的疼痛。（2）局部麻醉，由于河毒素的麻醉作用比一般的局部麻醉药要强上万倍，故国外已有河毒素与普通麻醉药配伍而作为麻醉药的专利出售。（3）镇静，可用作瘙痒镇静剂，对于皮肤瘙痒症、疥癣、皮炎等可以止痒，进而促使其痊愈。也可用作呼吸镇静剂，治疗气喘和百日咳等症。（4）镇痉，作为解痉剂，用于松弛肌肉痉挛、胃痉挛和其它痉挛，对破伤风痉挛的解痉效果尤为显著。（5）降压，河毒素有独特的降血压效果可以考虑在临床上用来抢救高血压患者。（6）抗心律失常，河毒素有明显的抗心律失常活性，若与其他抗心律失常药物配用，可显著增强对心律失常的疗效。（7）其它，作尿意镇静剂，用于遗尿症的治疗，对男性阳痿及妇女性欲缺乏症等也有一定的疗效。

神经生物学家证实微量毒液就有治疗作用。河鲀毒素也可作为局部麻醉药，其局部麻醉作用比一般麻药强。国外已有将河鲀毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河鲀毒素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人24h持续杜冷丁治疗收效甚微，而注射河鲀毒素，每天2次，连续3天疼痛便缓解。河鲀毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈痛楚，还可治疗顽固性哮喘等。中国研究人员发现，河鲀毒素还是一种戒毒良药。研究人员对吸毒者进行试验，在注射极微量的河鲀毒素后，所有各种“戒毒综合症”在30 min后全部消失。连续注射5 d后可完全戒除毒瘾，且没有副作用。1998年，加拿大国际韦克斯技术公司利用河鲀毒素成功研制成一种名为tetrodin的戒毒新药。利用河鲀毒素来戒除毒瘾，可谓“以毒攻毒”的一大创举。

限制河毒素成为药物的最大问题在于有效剂量与有毒剂量十分接近，临床用药方面的应用应以降低毒性为前提。因此如采用化学合成、修饰技术，对TTX进行改构，特异性地增强镇痛作用而降低毒性，则能推动河毒素的商品化进程。

河鲀毒素是特异性强的Na+通道阻断剂。当其位于膜外侧与钠离子通道受体部位Ⅰ结合，能阻止钠离子进入细胞内，从而阻断电压依赖性钠通道，影响细胞膜动作电位的产生和传导，阻滞动作电位，抑制与之相关的生理活动。研究表明，河鲀毒素对Na+通道的影响可能是其镇痛的机制。 

中枢性镇痛药吗啡对各种疼痛均有强大的抑制作用，但因对之容易产生耐受性和成瘾性而不能广泛和连续使用，而河鲀毒素对多种钝痛及锐痛均有缓解作用，且不会对之产生依赖性，可减轻晚期癌症患者的疼痛。单独使用河鲀毒素也具有一定镇痛作用，能够抑制甲醛引起的炎症性疼痛和水肿；河鲀毒素与茚虫威联合应用有协同镇痛抗炎作用，在早期两者联合使用，其镇痛强度与吗啡相差不多，在晚期给药作用极其显著，镇痛强度远远超过吗啡；小剂量河鲀毒素和阿司匹林联合使用能明显提高镇痛疗效。河鲀毒素也具有很强的局部麻醉作用，其效力比常用局麻药强千倍以上，持续时间也明显延长；河鲀毒素具有镇痛作用，用醋酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生疼痛，表现为扭体反应。微量河鲀毒素或者微量河鲀毒素联合小剂量的戊巴比妥钠注射到小鼠体内后，小鼠扭体的频率降低。河鲀毒素对器官的缺血性损伤具有保护作用，可明显降低脑梗死的体积及神经功能缺失的症状。河鲀毒素对常规心律失常具有较好的拮抗作用，特别是在抗室颤方面效果显著。但是以上实验均是在小鼠或兔子身上做的，还没有应用到临床医学上。动物实验发现，河鲀毒素对吗啡戒断反应具有明显的抑制作用，可以用作阿片类毒品的戒毒药物。加拿大科学家已经将其应用于临床，效果比较显著。另外，河鲀毒素在治疗癌症、延缓衰老和提高免疫力等方面也取得了显著的成效。

临床上若使用河鲀毒素剂量过大，会导致远端神经受损，而神经损害可累及神经根、植物神经和中枢神经。因此，为了避免河鲀毒素在临床应用中产生全身毒性反应，已研制出河鲀毒素微胶囊，将其分散地移植到坐骨神经的细胞膜下，既能起到局部麻醉的作用，又能降低对神经系统的毒性。河鲀毒素微胶囊的研发成功，可以使河鲀毒素在临床上得到广泛应用。河鲀毒素与神经变性有关。用河鲀毒素处理神经胶质细胞，导致692个细胞基因表达发生异常。因此，河鲀毒素作为一种神经毒素，为研究基因的表达规律及神经衰退机制提供了一条新途径。另外，河鲀毒素还可治疗与睡眠相关的疾病。在网状脑桥嘴核和蓝斑下核内微量注射河鲀毒素，它们的活性受到抑制，导致快速眼动睡眠时间和非快速眼动睡眠时间减少，证明河鲀毒素能降低脑桥区的活性，影响生物的睡眠—觉醒状态。

预防与救治

河鲀鱼营养丰富，味道鲜美，有长江第一鲜之称。河鲀鱼的食用在中国、日本等亚洲国家有着悠久的历史，并逐渐形成特有的河鲀饮食文化。日本还将河鲀宴视作国宴，招待贵宾。然而，即使对河鲀烹调人员进行专业培训，饭店得到卫生部门许可及实施特许经营，如加工处理不当，还会引起食物中毒及致残致死事故，严重威胁人们的生命安全。统计在1972-1993年间，仅日本发生河鲀中毒者就达1258人，致死279人之多。中国河鲀中毒事件较多，最高为1993年，死亡147人。

河豚毒素对热稳定，于100℃处理24h或120℃处理20-60min方可使毒素完全破坏。中国古书曾记载“河豚出于江海，有大毒，能杀人。”明代黄省曾的《鱼经》云：“凡烹调者，腹之子、目之精、脊之血必尽弃之。”“凡洗宜极净，煮宜极熟，治之不中度，不熟则毒于人。”这说明在烹调过程中河豚毒素是很难除去。因此：加强河豚鱼知识宣传，了解毒性，避免误食或贪其美味但处理不当而中毒；对于某些毒性较小的河豚鱼品种应在专门单位由有经验的人进行加工处理之后制成罐头或干制品用于食用。

由于河豚毒素在极低浓度即可阻塞Na+通道，使河豚鱼中毒潜伏期缩短，绝大多数在食用后1045 min发病，病情发展迅速，先是皮肤有麻或刺痛感，很快延及手指、四肢及其它部位，产生广泛的肌肉麻痹；消化系统出现呕吐、腹泻，严重者可致呼吸肌麻痹、血压下降、循环衰竭。国内外尚无特效解毒剂，一般采用综合对症治疗措施，如早期服用1%硫酸铜100 mL催吐；用1:5 000高锰酸钾或0.2%活性炭悬浮液洗胃；静脉注射高渗或等渗葡萄糖溶液，以促进毒素的尽快排泄；维持呼吸；解毒，莨菪类药物包括阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱等大剂量应用对救治河豚鱼类中毒有显著效果；肌肉麻痹者可肌注1%盐酸士的宁2ml及维生素B2、B6去麻痹，咖啡因、山梗烷醇酮和硫代硫酸钠与生理盐水一起静脉注射也有显著疗效。同时可采取补液等对症治疗措施。

自1990年《水产品卫生管理办法》颁布以来，中国的法律规定就禁止食用鲜河鲀，这是基于生长在深海的剧毒河鲀鱼肌肉有毒而作出的防范规定。江苏省地方标准DB32/T 543-2002“无公害家化暗纹东方鲀安全加工操作规范”规定该品种的肌肉TTX含量不应超过10MU/g，而其余部位包括卵巢、肝脏、脾、肾、血液、眼球、胆、胃、肠、心脏、腮均作为有毒废弃物处理。